3.1. Réponses cellulaires et moléculaires des populations microbiennes au stress UV

 

 

3.1.1. Étude des mécanismes de photoadaptation des cyanobactéries marines

 

3.1.1.1. Dispositif expérimental de culture sous lumière UV/visible

 

Des études préliminaires de l’effet des UV sur le métabolisme des cyanobactéries marines seront menées à la SBR en conditions de lumière continue en comparant des souches cultivées sous lumière visible (PAR) seule (contrôles) et avec des UV-A et/ou des UV-B (cultures expérimentales). Par la suite, nous prévoyons d’adapter un système de culture sous lumière modulée qui a fait ses preuves pour l’étude de la rythmicité diurne du métabolisme et de l’expression génique chez Prochlorococcus (Bruyant et al., 2001). Ce système développé par l’équipe d’Optique Marine de Villefranche-sur-mer a permis de simuler une courbe en cloche de PAR très similaire à celle que l’on peut mesurer vers 25 m en milieu oligotrophe. Notre ambition est de remonter un système équivalent à la SBR mais, 1) en l’adaptant pour qu’il délivre des flux de photons PAR encore plus forts, tels que l’on en mesure dans les premiers 10 m de la couche euphotique, et 2) en lui adjoignant un système indépendant de lampes UV-A et UV-B, si possible également contrôlées par ordinateur pour délivrer un flux de photons variable en fonction de l’heure de la journée. Idéalement, le système obtenu devrait permettre de mieux rendre compte de l’effet sur le métabolisme des stress UV périodiques subis par les organismes dans la couche supérieure des océans.

 

3.1.1.2. Paramètres étudiés 

 

Une souche représentative des populations de surface de Prochlorococcus (MED4) et une souche de Synechococcus (WH8102) seront soumises à différentes conditions de stress en lumière visible et UV. Dans un premier temps, nous étudierons l’effet de ces différentes conditions lumineuses sur le protéome. L’approche prévue inclut l’utilisation de gels d’électrophorèse bidimensionnelle qui permettront de séparer les différentes protéines des organismes étudiés (il est possible qu’il soit nécessaire de travailler sur des fractions cellulaires). La comparaison des gels en conditions de stress et en conditions témoins sans stress permettra d’identifier des spots de protéines différentiellement exprimées. L’analyse de leur séquence N-terminale par spectrométrie de masse sera réalisée à Rennes (dans le laboratoire de C. Pineau). Cette information permettra d’identifier les gènes correspondants en utilisant la base de données génomique disponibles pour ces deux souches. L’expression des gènes les plus intéressants sera ensuite étudiée par RT-PCR quantitative dans différentes conditions de lumière, afin de mieux comprendre leur rôle et leur dynamique.

 

Afin de compléter les informations acquises par les approches protéomique et moléculaire, plusieurs paramètres complémentaires pourront être mesurés sur les mêmes cultures, en collaboration avec les autres groupes participant au projet UVECO :

- la croissance et le cycle cellulaire, tels que mesurés par cytométrie en flux (Marie et al., 1999)

- la composition en pigments telle que mesurée par HPLC (chlorophylles, caroténoïdes) et spectrofuorimétrie (phycobiliprotéines) (collaboration avec F. Lantoine, OOB)

- la photosynthèse et la variation des paramètres photosynthétiques, telles que mesurées par incorporation du ¹⁴C (collaboration avec P. Conan, OOB)

- les dommages à l’ADN et protéines, tels que mesurés par la détection des dimères de thymidine et de protéines carbonylés par immunodétection en dot-blot, et les dommages lipidiques tels que mesurées par le malondialdehyde (collaboration avec F. Joux, OOB)

- enfin, les modifications biochimiques, tels que mesurés par les sucres et les acides aminés (collaboration avec R. Sempéré, LMM-COM)

 

3.1.1.3. Applications au milieu naturel

 

Les études protéomiques et moléculaires menées au laboratoire devraient permettre d’identifier un certain nombre de gènes des stress, qui pourraient constituer de bons marqueurs de  l’état physiologique (stressé ou non) des populations naturelles. L’expression de ces gènes sera spécifiquement étudiée par RT-PCR quantitative sur des échantillons naturels prélevés différentes heures du jour (6h, 9h, 12h, 15h, 18h) et à différentes profondeurs (ex : 1, 10, 20, 50 m) à des sites oligotrophes très ensoleillés (Pacifique, Méditerranée). Cette étude, qui sera complété par des mesures de la croissance par cytométrie en flux et plusieurs autres paramètres préalablement mesurés en culture (voir plus haut) devrait permettre d’identifier un éventuel rôle des UV sur le métabolisme et la dynamique des populations naturelles.

 

Laboratoires participants : SBR, LOOB, LMM-COM.

 

 

 

3.1.2. Étude du spectre d'action du rayonnement solaire et de la photoadaptation au stress UV chez deux modèles de bactéries marines hétérotrophes

 

 

3.1.2.1. Expériences avec simulateur solaire et cyclostat

 

L'étude du spectre d'action biologique (SAB) du rayonnement solaire sur la croissance cellulaire sera réalisée à partir du suivi de cultures en milieu minimum, maintenues sous les différentes conditions lumineuses décrites ci-dessous. L'étude du SAB sur les paramètres d'activités de synthèses et des dommages cellulaires sera quant à elle réalisée à partir de prélèvements de cellules en phase exponentielle et en phase stationnaire de croissance qui seront ensuite exposées aux différentes conditions lumineuses pendant quelques heures.

L'exposition des cellules bactériennes sera réalisée au laboratoire au moyen d'un simulateur solaire 1000 W équipé d'une lampe xénon (Lot-Oriel, France). Cette source lumineuse assure, par l'utilisation de filtres correcteurs, une illumination dans les UV-B, les UV-A et le visible identique à celle du rayonnement solaire à la surface de la terre. Pour une surface d'exposition de 25 cm x 25 cm, la distance entre la source lumineuse et les échantillons est de 30 cm et la puissance délivrée est de 310 W/m². Les échantillons seront maintenus en agitation en les plaçant sur un plateau avec une agitation orbitale. La température des échantillons sera maintenue à 18-20°C grâce à une plaque réfrigérante placée sur le plateau agitateur et reliée à un cryothermostat ministat (Huber).

 

Les coupures de longueurs d'ondes dans l'UV-B, les UV-A et le PAR seront réalisées au moyen de différents filtres Schott (WG-305, WG-320, WG-335, WG-360, GG-395, GG-420). De cette manière, chaque série d'essai sera constituée de 6 conditions différentes de filtration de la lumière d'exposition. Un échantillon de contrôle sera également maintenu à l'obscurité durant la période d'essai.

 

Le spectre d'action biologique de chaque paramètre étudié sera déterminé suivant les formulations mathématiques décrites par Rundel (1983). Cette détermination suppose que les effets des différentes longueurs d'ondes utilisées dans la réponse biologique mesurée sont additifs, et donc que la différence dans la réponse biologique mesurée entre deux conditions de coupure spectrale, résulte spécifiquement des longueurs d'ondes présentes entre ces deux conditions lumineuses.

 

Dans le cas des cultures en cyclostat nous étudierons l'effet de coupures spectrales simples (PAR / PAR+UV-A / PAR+UV-A+UV-B) sur les mêmes paramètres que ceux mesurés avec le simulateur solaire. Des échantillons seront également prélevés pour étudier les modifications du protéome des souches cultivées sous les différentes lumières. La culture en cyclostat sera maintenue pendant plusieurs jours de manière à pouvoir mettre en évidence une photoadaptation au non des souches bactériennes.

 

 

      3.1.2.2. Paramètres étudiés

 

Activité de croissance. L'étude de la croissance cellulaire sera réalisée à partir de comptages cellulaires en cytométrie en flux. Cette analyse permettra également d'étudier les variations du contenu en ADN des cellules et les modifications de taille estimée par la diffraction de la lumière.

 

Activités de synthèse. Les activités de synthèse d'ADN, de protéines et d'ARN seront mesurées par incorporation de thymidine, de leucine et d'uracile respectivement.

 

Modifications biochimiques, tels que mesurés par les sucres et les acides aminés (collaboration avec R. Semperé, LMM-COM).

 

Dommages à l'ADN. Les dimères de cyclobutane pyrimidine (CPD) seront dosés par immunodétection en dot-blot suivant le protocole établi par Boelen et al. (1999).

 

Oxydation des protéines. Les protéines oxydées seront quantifiées en dot-blot sur la base de la formation de groupes carbonylés qui peuvent réagir avec le 2,4-dinitrophenylhydrazine pour ensuite être détectés par un anticorps anti-2,4-dinitrophenol (DNP) (Tamarit et al., 1998).

 

Peroxidation des lipides membranaires. Le produit de la peroxidation des lipides membranaires (dialdehyde malonyl) sera dosé par l'acide thiobarbiturique (Rai et al., 1995).

 

Formation intracellulaire de composés d'oxygène réactifs. La présence intracellulaire de H₂O₂ et de O₂^l- sera évaluée en cytométrie en flux au moyen respectivement des marqueurs fluorescents dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA, Molecular Probes) et hydroethidine (HE, Polysciences Inc.) (Takeuchi et al., 2000).

 

Mesure de la production de protéines RecA. La protéine RecA est le premier facteur de régulation du système de réparation (régulon SOS). Ce régulon inclus les gènes en relation avec tous les processus de réparation à l’obscurité des bactéries (Miller et al., 1999 ; Miller, 2000 ; Booth et al., 2001). Ainsi, après des dommages UV de l’ADN, une activation de la protéine RecA est caractéristique des capacités de réparation des bactéries (Miller et al., 1999). (collaboration avec R. Sempéré, LMM-COM).

 

Étude protéomique. Après purification, les protéines des deux souches étudiées et exposées aux différentes conditions lumineuses seront expédiées au laboratoire de R. Cavicchioli dans le but d'analyser les variations du protéome. Le laboratoire de R. Cavicchioli possède une solide expérience dans l'étude du protéome de différentes souches bactériennes, dont celles étudiées dans le cadre de ce travail. Cette étude doit permettre l'identification par électrophorèse en deux dimensions, des principales protéines induites par le stress radiatif en fonction de la nature du rayonnement.

 

 

      3.1.2.3. Extension de l’étude à d'autres modèles bactériens

 

Il sera possible d'étendre le travail de photobiologie entrepris sur les deux modèles sus-cités, à d'autres modèles bactériens qui auront été isolés de la Méditerranée sur la base de leur dominance numérique ou de leur implication à certains cycles biogéochimiques. Ce travail d'isolement et de reconnaissance phylogénétique est entrepris dans le cadre des projets européens AIRWIN et BASICS dans lesquels participent P. Lebaron, J.-F. Ghiglione, F. Joux et P. Catala du LOOB, également participants au projet UVECO. Le projet BASICS travaillera notamment sur les communautés bactériennes impliquées dans le cycle du DMS/DMSP. Un travail de photobiologie sur l'une des souches dominantes de cette communauté, dont certaines affiliées au genre Roseobacter ont déjà été isolées (Gonzáles et al., 1999), viendra parfaitement compléter le travail entrepris dans l'objectif 3 du présent projet.

 

Laboratoires participants : LOOB, LMM-COM, LOB-COM, collaboration UNSW.

 

 

3.2. Étude expérimentales de l'impact du rayonnement UV et PAR sur la structure des composés organiques et sur son accessibilité par les bactéries marines

 

3.2.1. Impact du rayonnement UV et PAR sur la dégradation des acides gras, des polysaccharides et des protéines

 

Nous nous intéresserons notamment aux effets du rayonnement UVB-R sur les concentrations en carbone organique ainsi qu’aux taux de production de monomères de types acides aminés, sucres et diacides organiques (ainsi que ceto-acides) à partir de différents polymères de types protéines, polysaccharides et d’acides gras mono-insaturés. Pour cela nous étudierons les modifications de l’abondance relative des différents sucres, des acides aminés et des diacides avant et après exposition de la MOD à différentes doses de rayonnement.

 

      3.2.1.1. Dispositif expérimental d'exposition sous lumière UV/visible

 

Ces travaux seront réalisés par irradiation dans des flacons en quartz (qui permettent une pénétration du rayonnement UVB-R) et en pyrex de solutions de molécules standards (monomères et polymères).

 

      3.2.1.2. Paramètres étudiés 

 

-Modification de la composition du stock de MDOC,

 

- Variations des concentrations en DOC, de solutions naturelles d’eau de mer en fonction de l’exposition au rayonnement UV-B seront dosées par combustion catalytique à haute température (HTCO : Dafner et al., 2001 ; Sempéré et al., 2002)

 

- Dégradation photochimique des polysaccharides. La production de monosaccharides (glucose, fucose, ribose, galactose, fructose, mannose, arabinose, xylose, rhamnose, glucosamine, galactosamine) à partir de solutions synthétiques de polysaccharides de type (glucane, laminarin, xylane…), sera suivie par chromatographie d’échange anionique et ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD) (Panagiotopoulos et al., 2001 ; 2002).

 

- Dégradation photochimique des protéines. La production d’acides aminés individuels à partir de solutions synthétiques de protéines et de peptides de synthèse (Laboratoire de XXX de Luminy d’Aix-marseille II), sera suivie par HPLC et détection par fluorimétrie (Lindroth et Mopper, 1979).

 

- Dégradation photochimique des acides gras mono-insaturés. La production d’acides dicarboxyliques (C2-C10), de cétoacides (C2-C9) à partir de solutions d’acides gras dilués dans de l’eau ultrapure et de l’eau de mer synthétique sera suivie par chromatographie gazeuse  et spectrométrie de masse

 

Les dilutions seront effectuées avec de l’eau ultra-pure (Milli-Q) puis de l’eau de mer synthétique et naturelle. La capacité oxydante sur les polysaccharides des oxydes d’azote (NOx) (qui peuvent être des produits de photo-oxydation UVB-R des nitrates (NO₃^-)) sera testée par des ajouts de nitrates à des doses variées dans des solutions synthétiques. Ces travaux seront effectués à température contrôlée et par l’utilisation de lampes UV-R (A et B) et PAR dont le rayonnement sera mesuré par l’utilisation d’un radiomètre durant la durée de l’irradiation. Des expériences utilisant un rayonnement naturel mesuré par l’utilisation d'un radiomètre seront également effectuées.

Une collaboration est en cours avec K. Kawamura (Université de Sapporo, Japon) afin de réaliser des analyses des diacides en eau de mer après dessalement sans contamination (séjour de R. Sempéré à Sapporo en Juillet 2002). Une demande de poste rouge CNRS a été effectuée et devrait aboutir, en cas d’acceptation, vers un séjour de deux mois de K. Kawamura au LMM-COM en été 2003.  Une collaboration avec Ken Mopper (University Old Dominion, USA) est en cours pour les processus de photo-oxydation des aldoses et les mises au point analytiques HPAEC-PAD (cette collaboration s’est traduite par un séjour de deux mois en été 2001 de K. Mopper au LMM (poste rouge CNRS) et un séjour de quelques jours prévu en Octobre 2002) et de quelques semaines en été 2004 (demande de collaboration Franco-Américaine dans le cadre du prochain plan quadriennal 2004-2007 et de collaborations inter-universités).

 

 

 

 

3.2.2. Dégradation des composants lipidiques du phytoplancton par le rayonnement UVet PAR

 

 

Nous nous proposons de comparer l’effet du rayonnement UV et visible sur la dégradation de certains lipides insaturés du phytoplancton (stérols, acides gras insaturés et chaîne phytyle des chlorophylles). Pour cela des expérimentations de sénescence naturelle de diverses cultures phytoplanctoniques seront effectuées. Après des irradiations en parallèle par du rayonnement visible (PAR) et visible+UV les lipides résiduels seront quantifiés et leurs  photoproduits identifiés par CPG/SM.

 

      3.2.2.1. Dispositif expérimental d’exposition sous lumière UV/visible

 

Ces travaux seront réalisés dans des flacons en quartz sur différentes cultures phytoplanctoniques (Dunalliela tertiolecta, Skeletonema costatum, Chrysatila lamellosa). L’énergie lumineuse reçue sera mesurée à l’aide d’un quantamètre de manière à pouvoir déterminer des constantes de dégradation.

 

 

      3.2.2.2. Paramètres étudiés 

 

Vitesses de dégradation des lipides étudiés : Les constantes de dégradation des principaux composants lipidiques insaturés du phytoplancton seront déterminées (cinétiques de dégradation), ces constantes devraient nous permettre de comparer les effets de ces deux types de rayonnement.

 

Caractérisation et quantification des photoproduits formés par CPG/SM: Les différents photoproduits formés seront identifiés par comparaison de leurs spectres de masse et de leurs temps de rétention chromatographiques avec ceux de composés standards. La quantification de ces composés sera effectuée par étalonnage externe. Le but de cette étude est d’identifier des photoproduits suffisamment spécifiques de ces deux types de rayonnement, afin de pouvoir les utiliser comme traceurs in situ.

 

 

 

3.2.3. Impact du rayonnement UV et PAR sur le recyclage bactérien de la matière organique

 

 

Nous nous intéresserons aux effets du rayonnement UV- (A et B) et PAR sur le recyclage bactérien de la matière organique par deux types de travaux. Les premiers consisteront en une exposition à différents types et doses de rayonnement de molécules organiques (déjà citées) suivi d’une étude de l’efficacité d’assimilation et de minéralisation de ces composés par les bactéries hétérotrophes non irradiées (cinétique temps de dégradation et calcul de rendement de croissance). Le deuxième type d’étude consistera en une assimilation de composés organiques déjà cités après exposition à différents types et à différentes doses de rayonnement UV (A et B) et PAR de bactéries. Ces travaux seront réalisés dans un premier temps à partir de souches pures de bactéries (Sphingomonas alaskensis RB2256 et Vibrio angustum S14)et d’assemblage bactérien prélevés dans la zone côtière de Marseille (Sites SOFCOM et SOFI).

 

      3.2.3.1. Dispositif expérimental d'exposition sous lumière UV/visible

 

Ces travaux seront réalisés par irradiation dans des flacons en quartz (qui permettent une pénétration du rayonnement UVB-R) et en pyrex de solutions de molécules standards (monomères et polymères).

 

      3.2.3.2. Paramètres étudiés 

 

Cinétique de dégradation des composés organiques étudiés (sucres, protéines, acides gras). Les constantes de dégradation seront calculées à partir du suivi de la décroissance de concentrations des différents composés étudiés en fonction du temps et en appliquant un modèle de dégradation du second ordre.

 

Calcul du rendement de croissance (BGE). Le calcul du BGE sera effectué à partir du suivi de la production bactérienne et la concentration en oxygène et l’utilisation d’un coefficient respiratoire durant une expérience de dégradation (Sempéré et al., 1998). L’oxygène consommé durant la décomposition sera titré par la méthode de Winkler.

 

Les modifications et l’intensité des dommages bactériens préjudiciables à l’assimilation de composés organiques. Ces paramètres seront suivis par la détermination de l’intégrité membranaire ainsi que par le suivi de la synthèse de la protéine RecA à partir du gène recA caractéristique des stress UV des bactéries (Booth et al., 2001 et références internes). Mesure de la production de protéines RecA. La protéine RecA est le premier facteur de régulation du système de réparation (régulon SOS). Ce régulon inclus les gènes en relation avec tous les processus de réparation à l’obscurité des bactéries (Miller et al., 1999 ; Miller, 2000 ; Booth et al., 2001). Ainsi, après des dommages UV de l’ADN, une activation de la protéine RecA est caractéristique des capacités de réparation des bactéries (Miller et al., 1999).

 

Les variations des propriétés optiques de solutions synthétiques (eau ultrapure enrichie en composés organiques (sucres, protéines, acides gras en présence de photosensibilisateurs) et de solutions naturelles seront mesurées par le suivi de l’absorbtion des radiations de longueurs d’onde 200-500 nm mesurées par spectrophotométrie.

 

Dégradation photochimique des polysaccharides. La production de monosaccharides (glucose, fucose, ribose, galactose, fructose, mannose, arabinose, xylose, rhamnose, glucosamine, galactosamine) à partir de solutions synthétiques de polysaccharides de type (glucane, laminarin, xylane…), sera suivie par Chromatographie d’échange anionique et ampérométrie pulsée (HPAEC-PAD) (Panagiotopoulos et al., 2001 ; 2002).

 

Dégradation photochimique des protéines. La production d’acides aminés individuels à partir de solutions synthétiques de protéines et de peptides de synthèse (Laboratoire de XXX de Luminy d’Aix-marseille II), sera suivie par HPLC et détection par fluorimétrie (Lindroth et Mopper, 1979).

 

Dégradation photochimique des acides gras mono-insaturés. La production d’acides dicarboxyliques (C2-C10), de cétoacides (C2-C9) à partir de solutions d’acides gras dilués dans de l’eau ultrapure et de l’eau de mer synthétique sera suivie par chromatographie gazeuse  et spectrométrie de masse (Kawamura, 1993 ; Sempéré et Kawamura, 1996).

 

Laboratoires participants : LMM-COM, LOB-COM, LBCM-Paris 6, collaborations (K. Kawamura, Institute Low Temperature, Sapporo, Japon  et K. Mopper, University Old Dominion, USA)

 

 

 

 

3.3. Étude in-situ de l'impact du rayonnement UV sur les flux de carbone à la surface de l'océan entre les compartiments MOD / bactéries / phytoplancton. Modélisation des processus.

 

 

3.3.1. Dispositif d'incubations in-situ

 

 

Les échantillons seront prélevés en début de matinée aux différentes profondeurs étudiées, puis distribués dans des flaconnages appropriés, avant d'être fixés sur le dispositif d'incubation et replacés à la profondeur de prélèvement. Le temps de préparation des échantillons sera inférieur à 1 h. Un dispositif d'incubation en surface et à 4 profondeurs différentes sera spécialement construit dans le cadre du projet UVECO (Fig. 4). Les supports sur lesquel le flaconnage sera fixé, sera constitué de plaques d'acrylique transparentes aux UV (Altuglas® CN, Altumax) afin d'éviter toute réflexion d'UV sur le matériau. Les échantillons seront récupérés en fin d'après-midi afin d'être analysés ou placés en incubation à l'obscurité.

 

Des profils de pénétration du rayonnement UV-B, UV-A et PAR seront réalisés durant la période de l'expérience (radiomètres submersibles S.Atlantic, Eldonet) et ces mêmes rayonnements seront mesurés en continu sur le pont du bateau (radiomètres de surface S.Atlantic, Eldonet). Ces différentes données permettront de calculer les doses d'UV-B, d'UV-A et de PAR aux différentes profondeurs étudiées.

 

 

 

3.3.2. Paramètres étudiés

 

Pour chaque type de paramètre étudié, 4 filtrations du rayonnement solaire seront testées à chaque profondeur :

 

-          échantillons recevant le rayonnement solaire global (PAR+UV-A+UV-B) : flaconnage en quartz.

-          échantillons recevant le rayonnement UV-A et PAR : flaconnage en quartz recouvert d'un film Mylar (50% de transmission à 320 nm),

-          échantillons recevant le rayonnement PAR seul : flaconnage en Pyrex recouvert d'un film Lexan, (50% de transmission à 395 nm),

-          échantillons maintenus à l'obscurité : flaconnage opaque en Pyrex recouvert.

 

 

      3.3.2.1. Production primaire en fonction de la classe de taille du phytoplancton

 

La biomasse phytoplanctonique des échantillons sera quantifiée et caractérisée par spectrofluorométrie des pigments photosynthétiques, en procédant à un fractionnement de taille afin de séparer le micro- (> 20 µm), le nano- (entre 20 et 2 µm), et pico-phytoplancton (< 2µm). La concentration des différentes composantes du  picophytoplancton (Prochlorococcus, Synechococcus, eucaryotes) sera également mesurée en cytométrie de flux sur chacun des échantillons. La production primaire sera mesurée sur la base de l'incorporation de bicarbonate de sodium marqué (¹⁴C) qui sera injecté dans des tubes de 350 ml en début d'expérience (Steemann-Nielsen 1952 ; Fitzwater and Knauer et al. 1982). En fin de journée, les échantillons seront récupérs, puis filtrés sur GF/F pour mesurer la production primaire. Un fractionnement de taille sera également réalisé sur les échantillons de surface et en profondeur afin de mesurer la production de chaque classe de taille en fonction de la nature de l'exposition.

 

D'autres mesures plus spécifiques seront réalisées uniquement sur les échantillons incubés en surface :

-          Des expériences de type time-series (1 point toutes les 2 ou 4 heures) seront réalisées pour mesurer l'évolution de l'impact au cours des différents traitements lumineux afin de déterminer l'effet de la dose de rayonnement reçue sur l'intensité des réponses biologiques. Il s'agira également de suivre l'évolution de cet impact au cours de phases d'obscurité de manière à estimer l'effet des processus de "réparation".

-          Les paramètres photosynthétiques seront mesurés par la réalisation de courbes PvsI (Babin et al., 1996) dans un incubateur spécialement conçu pour accueillir jusqu'à 8 échantillons différents simultanément exposés chacun à 15 niveaux d'éclairement. La détermination des paramètres photosynthétiques (P^b_m, a^b, I_k) permettra de suivre l'état physiologique des populations autotrophes (Falkowski et Raven, 1997). Ces paramètres sont généralement considérés comme de bons indicateurs des perturbations du système productifs des organismes sous l'influence des UV (Behrenfeld et Lean, 1995).

- Une approche nouvelle sera développée de manière à suivre en "semi-continu" l'évolution de l'impact des UV sur le compartiment phytoplanctonique. Il s'agit de mesurer en "circuit fermé", l'évolution du signal de Luminescence Lente d'un échantillon d'eau de mer. Après une excitation lumineuse saturante, la cinétique d'émission de lumière par l'échantillon est suivie pendant une période de l'ordre de la minute. L'intensité maximale (fluorescence), l'intégrale et la décroissance du signal (luminescence lente) devraient permettre de caractériser l'état physiologique de la population et l'évolution du stress au cours du temps. La mesure de la LL peut être effectuée toutes les 2 à 5 minutes sur un échantillon de 300 ml.

 

 

      3.3.2.2. Excrétion de MOD par le phytoplancton

 

Outre des mesures ponctuelles d'excrétion lors des expériences d'estimation de la production primaires, des profils spécifiques pour la mesure de l'excrétion phytoplanctonique avant et après éclairement seront réalisés. Il s'agira de placer 6 tubes en quartz et 6 tubes en pyrex à 2 ou 3 niveaux. Après échantillonnage, 3 de chacun des 6 tubes seront inoculés à l'aide d'une solution radioactive de ¹⁴C, puis l'ensemble des tubes sera placé in situ à la profondeur d'échantillonnage. Après 8-12 h d'incubation, les trois tubes par niveaux et par condition serviront à estimer la production primaire totale et excrétée selon le protocole détaillé par Gosselin et al. (1997). Les 3 tubes par niveau et par condition seront alors inoculés à l'aide de la solution radioactive de ¹⁴C et placé sous un éclairage contrôlé et continu en chambre thermostatée pendant 4 à 8 h. Ces échantillons recevront ensuite le même traitement que les précédents. Les résultats obtenus permettront de comparer les valeurs de la production primaire et de l'excrétion avant et après incubation sous l'effet des UV.

 

      3.3.2.3. Mesure de la production et de la respiration bactériennes 

 

La concentration des bactéries hétérotrophes sera mesurée sur les différents échantillons par cytométrie en flux. La production bactérienne (PB) sera mesurée par incorporation de thymidine et de leucine tritiée sur les différents échantillons prélevés. Les échantillons servant à la mesure de la PB seront préparés comme suit :

-          échantillon "brut" (non filtré) : 1 bouteille BOD 250 ml / profondeur / condition de lumière.

-          échantillon filtré sur 0,8 µm : 1 bouteille BOD 250 ml / profondeur / condition de lumière.

Ces différentes bouteilles seront échantillonnées en fin d'exposition (T1), puis après 10 h à l'obscurité (T2) pour effectuer une mesure de PB. La mesure après exposition permettra de mettre en évidence l'inhibition causée par les différentes bandes spectrales (comparativement à la mesure de PB effectuée dans les échantillons maintenus à l'obscurité), et la mesure effectuée après la phase d'obscurité, permettra de mettre en évidence les capacités des bactéries à mettre en place des mécanismes de réparation. Les mesures effectuées sur les échantillons filtrés sur 0,8 µm permettront de s'affranchir de l'excrétion de MOD par le phytoplancton qui est susceptible d'interférer avec l'effet direct du rayonnement solaire sur les bactéries.

 

La respiration bactérienne (RB) sera mesurée par consommation d'oxygène (Méthode de Winkler avec détection par photométrie ou potentiométrie) pour les échantillons de surface et ceux de la profondeur maximale, de la manière suivante : les échantillons seront filtrés sur 0,8 µm, puis distribués dans 3 bouteilles par type d'échantillon et par type de condition d'exposition à la lumière. Les échantillons seront ensuite replacés à leur profondeur de prélèvement durant la journée. En fin de journée, les échantillons seront récupérés et incubés à l'obscurité pendant 10 h à la température in situ (bac avec circulation d'eau). La mesure de la consommation d'oxygène sera alors réalisée (T2). Cette mesure sera corrigée en retranchant la quantité d'O₂ consommé par le processus de photo-oxydation directe de la MOD. La quantité d'O₂ consommée par les bactéries sera corrigée de la consommation d'O₂ par le processus de photo-oxydation directe de la MOD, puis transformée en quantité de carbone en utilisant une valeur de quotient respiratoire de 1.

Pour chaque condition d'exposition au rayonnement solaire étudiée, le rendement de croissance (BGE) sera déterminé pour l'échantillon de surface et celui prélevé le plus profondeur, comme suit :

BGE = ò PB_(T0-T2) / (ò PB_(T0-T2)  + ò RB_(T0-T2)).

 

      3.3.2.4. Activité exo-enzymatique et intégrité membranaire des bactéries

 

L'activité exoenzymatique de protéases, de glucosidases et de lipases sera mesurée par l'utilisation de susbtrats fluorescents.

L’intégrité membranaire des bactéries sera également mesurée par cytométrie en flux (collaboration M. Denis, LOB-COM).

 

      3.3.2.5. Modifications photochimiques de la MOD et conséquences sur l'activité bactérienne

 

Les modifications de la MOD seront étudiées par les paramètres suivants :

-          concentrations en COD, NOD, POD.

-          concentrations en acides aminés, sucres.

-          Photo-oxydation  de la MOD (mesures de DIC, NH4, PO4, NO3, NO2).

Nous étudierons les effets des modifications photochimiques de la MOD sur les cinétiques de dégradation bactérienne par le suivi des vitesses de dégradation de la matière organique photo-oxydée et la détermination des rendements de croissance bactérien (Sempéré et al., 1998; Sempéré et al., 2000; Sempéré et al., 2002; Panagiotopoulos et al., 2002). Le rayonnement UV-R agit également directement sur les bactéries et nous étudierons également ces processus de dégradation de la matière organique (photo-oxydée ou pas) après irradiation des assemblages bactériens. La consommation d’oxygène sera mesurée par la méthode de Winkler.

Les échantillons seront prélevés à deux profondeurs (surface et 200 m) ramenés au laboratoire et filtrés au laboratoire  immédiatement après prélèvement suivant le protocole suivant :

Filtration à 0.8 mm pour préparer un innoculum bactérien : volume traité (4 litres)

Filtration à 0.2 mm pour préparer une solution libre en bactéries et ne contenant que la DOM (4 litres, solution ‘DOM’).

Ces solutions seront ensuite exposées aux UV-R naturel dans des flacons en quartz et/ou laissées à l’obscurité dans des flacons en pyrex recouverts de papier aluminium.

Avant et après exposition, une mesure de la protéine RecA ainsi qu’une mesure de production bactérienne seront effectuées dans les innocula pour estimer l’intensité des dommages bactériens. Les concentrations en composés labiles (sucres et protéines, et acides dicarboxyliques) seront déterminées avant et après exposition.  Ces solutions seront ensuite mélangées (20% d’innoculum et 80% de solution ‘DOM’ et incubées pendant 72 h à l’obscurité. Des mesures d’oxygène et de production bactérienne réalisées avant et après l’exposition permettront le calcul du rendement de croissance après exposition de production bactérienne. Les mesures des composés dissous permettront un calcul de vitesse d’assimilation.

 

3.3.3. Modélisation des processus

 

Les résultats acquis lors de ces expériences pourront être utilisés pour calibrer, puis valider un modèle écologique décrivant les principaux processus impliqués (Fig. 4). L’évolution des compartiments carbonés étant intimement liée à celle des éléments limitants de la Mer Méditerranée (azote, phosphore), l’idée est de coupler ces cycles en utilisant un modèle stoichiométrique simple (Touratier et al., 1999a, 2000, 2001). Les mesures de DON, DOP et de sels nutritifs envisagées dans UVECO permettront de contraindre de manière efficace le comportement du modèle. L’atténuation des rayons UV avec la profondeur sera utilisée comme variable forçante dans l’effort de modélisation.

 

 

 
 

 

 

Fig. 4. Compartiments et flux considérés dans le modèle

 

 

 

Laboratoires participants : LOOB, LMM-COM, LOB-COM, CEFREM.

3.4. Impact du rayonnement UV sur les processus de dégradation biologique et photochimique du DMS et du DMSP

 

3.4.1. Rôle de la qualité de la DOM dans le processus de photolyse du DMS

 

Les expériences de photolyse seront réalisées à Banyuls (atelier de travail août-septembre 2003) à partir de différents échantillons prélevés au site SOLA dans le cadre du suivi hebdomadaire de la station. Un total de 6 échantillons sera étudié couvrant différentes périodes de l'année. Les échantillons seront prélevés en surface (3 m), ramenés au LOOB dans une glacière, avant d'être filtrés sur 0,2 µm et conservés à -20°C en suivant les recommandations de Kieber et al. (1996). Avant congélation, des aliquotes seront prélevées afin d'analyser la concentration en COD (collaboration M. Pujo-Pay, LOOB). Les données du service d'observation de la station SOLA seront utilisées pour caractériser les échantillons étudiés sur le plan biologique et chimique (Chl a, sels nutritifs, température, salinité, …).

Les échantillons seront décongelés au moment de l'expérience. Afin d'ajuster la concentration en DOC sur la valeur la plus faible mesurée préalablement, et ainsi s'affranchir de l'aspect quantitatif de la MOD, de l'eau Milli-Q sera ajoutée en proportion adéquate dans les différents échantillons. Les modifications de salinité, de pH, et de concentration en métaux traces engendrées par l'ajout d'eau Milli-Q non pas d'effets sur le processus de photolyse (Brugger et al., 1998). Après cette opération des aliquotes seront prélevées afin d'analyser la concentration en DMS, en acides aminés, en sucres et en MOD colorée (collaborations R. Sempéré, LMM-COM; F. Joux, LOOB). Une solution de DMS sera ensuite injectée dans les échantillons à une concentration de 50 nM. Après homogénéisation, les échantillons seront répartis dans des tubes à essais en quartz de 20 ml, fermés par un bouchon en borosilicate avec un joint en Téflon. Les tubes seront exposés sous la lumière d'un simulateur solaire 1000 W suivant quatre coupures spectrales : PAR; PAR+UV-A, PAR+UV-A+UV-B; obscurité. La cinétique de photolyse sera décrite en utilisant 4 temps d'exposition (de 0 à 24 h). Après exposition la quantité de DMS et la fluorescence de la MOD colorée seront analysées dans chaque échantillon afin décrire la cinétique de photolyse du DMS et de photobleaching de la MOD respectivement.

 

 

3.4.2. Rôle de l'assimilation de DMSP par les bactéries dans leur réponse au stress UV

 

Le rôle de la prise de DMSP par les bactéries en tant que facteur de défense en réponse au stress UV sera étudié en deux temps : 1) effet d'un ajout de DMPS à des bactéries marines antérieur au stress UV ; 2) effet d'un ajout de DMSP à des bactéries postérieur au stress UV.

Dans la première expérience, un échantillon d'eau prélevé en surface dans la Baie de Banyuls sera filtré sur 0,8 µm et réparti dans deux bidons Nalgène de 10 litres. L'un d'entre eux recevra un ajout de DMSP à une concentration de 100 nM. Après 12 heures de maintien à l'obscurité et à température in situ, la biomasse bactérienne, la production bactérienne, et la prise de DMSP par les bactéries seront mesurées. Chaque échantillon sera ensuite réparti dans des 4 tubes en quartz de 1,2 L qui seront exposés pendant 6 heures au rayonnement solaire dans un bac d'incubation avec une circulation d'eau. Les tubes seront recouverts de papier aluminium ou de filtres plastique de manière à étudier les 4 conditions lumineuses décrites dans l'objectif 2. En fin d'incubation, la production bactérienne sera mesurée dans chaque tube. Les tubes seront ensuite incubés 12 h à l'obscurité, puis une nouvelle mesure de production bactérienne sera effectuée dans chaque tube. Ces différentes mesures de production bactérienne permettront de mettre en évidence l'effet bénéfique ou non du DMSP dans l'atténuation de l'effet inhibiteur du rayonnement solaire et dans la reprise d'activité après le stress radiatif. Cet effet bénéfique sera apprécié en fonction de la nature du rayonnement solaire reçu.

Dans la deuxième expérience, nous testerons l'effet d'un ajout de DMSP postérieur au stress radiatif. Dans ce cas l'échantillon sera filtré sur 0,8 µm puis distribué dans 4 tubes en quartz de 1,2 L qui seront exposés au rayonnement solaire dans les mêmes conditions que celles décrites précédemment. Après exposition la production bactérienne sera mesurée dans chaque tube, puis le volume de chaque tube sera divisé en deux, l'un recevant un ajout de DMSP (100 nM), l'autre non. Ces différents échantillons seront incubés à l'obscurité pendant 12 h à température ambiante, après quoi une nouvelle mesure de production bactérienne sera effectuée.

 

3.4.3. Rôle du rayonnement UV dans la distribution verticale des processus de photolyse du DMS et de la dégradation bactérienne du DMSP

 

Le système d'incubation in situ détaillé dans l'objectif 2 sera utilisé ici pour mesurer les processus de photolyse du DMS et la dégradation bactérienne du DMSP dans la colonne d'eau. Trois séries d'expériences seront réalisées durant l'atelier DMS/DMSP à Banyuls (août-septembre 2003) sur le même site d'échantillonnage (station à 4 miles de la côte) à des jours différents et avec des couvertures nuageuses différentes.

Des profils de pénétration du rayonnement UV-B, UV-A et PAR seront réalisés durant la période de l'expérience (radiomètres submersibles S.Atlantic, Eldonet) et ces mêmes rayonnements seront mesurés en continu sur le pont du bateau (radiomètres de surface S.Atlantic, Eldonet). Ces différentes données permettront de calculer les doses d'UV-B, d'UV-A et de PAR aux différentes profondeurs étudiées.

Un échantillon d'eau sera prélevé en surface en début de matinée, puis filtré sur 0,8 µm (bactéries + MOD) ou sur 0,2 µm (MOD). Les deux types de filtrats seront enrichis en DMS et en DMSP, puis répartis dans des flacons en quartz de 250 ml fermés hermétiquement par des bouchons en verre. Les échantillons seront remis en incubation sur le site d'échantillonnage dans la matinée à trois profondeurs différentes : 2, 6, 10 m. Pour chaque profondeur, 4 flacons en quartz de 250 ml (MOD), et 4 autres flacons en quartz de 250 ml (MOD + bactéries) seront fixés sur le plateau de plexiglas. Ces différents flacons seront recouverts de papier aluminium ou de films plastique de manière à étudier pour chaque type d'échantillon les 4 conditions lumineuses décrites dans l'objectif 2.

Les échantillons seront incubés in situ et récupérés en fin d'après-midi afin de mesurer les concentrations de DMS et de DMSP dans tous les flacons, et la production bactérienne dans les échantillons (MOD + bactéries). Ces différentes mesures permettront d'apprécier les processus de photolyse du DMS de la dégradation bactérienne du DMSP et de l'inhibition de l'activité bactérienne par le rayonnement solaire (Slezak et al., 2001).

 

 

Laboratoires participants : LSCE, LOOB, LMM-COM.