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Méthode d'analyse de pigments phytoplanctoniques

Filtration : 2,8 L d'eau de mer sont filtrés à travers une membrane Whatman GF/F de 0,7 µm de porosité. Une mesure d'absorption particulaire est effectuée avant de stocker le filtre dans l'azote liquide.

 

Extraction dans 3 mL de méthanol. Après 30 minutes à -20°C, les filtres sont broyés à l'aide d'une tige à ultra-sons puis retournés au congélateur. 30 minutes plus tard l'extrait est clarifié à travers une membrane Whatman GF/C de 1,3 µm de porosité et conservé à -20°C jusqu'à analyse (sous 24h).

 

Analyse par Chromatographie Liquide à Haute Performance (Instrumentation : série 1100 d'Agilent Technologies et passeur automatique AS3000 de Thermo-Finnigan). La séparation est effectuée avec un gradient entre un mélange méthanol:acétate d'ammonium (70 :30) et une solution de 100% méthanol à travers une colonne à phase inverse Hypersil C8 (MOS ; 3µm ; 3mmx100mm). La détection est assurée par un détecteur à barette de diodes avec des signaux à 440 nm et à 667 nm. Les différents pics sont identifiés sur la base des temps de rétention mais surtout grâce à leur spectre d'absorption (logiciel Chemstation). Une description plus détaillée de la méthode est décrite par Claustre et al. (2003).

 

La quantification repose sur un calcul impliquant la surface des pics et leurs coefficients d'extinction spécifiques respectifs. Les concentrations sont en mg.m^-3.

 

La calibration est effectuée à l'aide de 8 standards externes (Péridinine, 19'-Butanoyloxyfucoxanthine, Fucoxanthine, 19'-Hexanoyloxyfucoxanthine, Alloxanthine, Zéaxanthine, Chlorophylle b, Chlorophylle a) fournis par DHI (International Agency for C14 determination, Danemark). Les facteurs de réponse sont d'abord déterminés par spectrophotométrie suivie par l'analyse par HPLC. Ces facteurs de réponse sont ensuite utilisés dans le calcul des coefficients d'extinction spécifiques pour ces 8 standards. Les coefficients d'extinction spécifiques des autres pigments sont dérivés soit de calibrations précédentes ou de la littérature (Jeffrey et al. 1997).

 

La validation est assurée à plusieurs niveaux :

-          l'utilisation d'un standard interne (beta-apo-8'-carotenal) permet de corriger pour les pertes durant l'extraction et/ou l'injection.

-          L'analyse d'une solution contenant uniquement du standard interne tous les 10 échantillons, permet de contrôler la bonne précision de l'appareil au cours d'une séquence d'analyse.

-          Les valeurs de Chlorophylle a Totale ont été comparées aux valeurs de fluorescence des fichiers bouteilles, afin de déceler des problèmes ou erreurs de manipulation.

-          Les valeurs de Chlorophylle a Totale ont également été comparées aux mesures d'absorption particulaires (effectuées sur le même filtre)

 

Performance de la méthode : cette méthode fait preuve d'une grande sensibilité avec des limites de détection pour la Chlorophylle a d'environ 0,001 mg.m^-3 ainsi qu'une bonne résolution entre la Divinyl Chlorophylle a et la Chlorophylle a. La précision de la méthode est généralement supérieure à 99%. La participation à un exercice d'intercomparaison HPLC impliquant 4 laboratoires différents (Claustre et al, 2003), a montré que les résultats du LOV étaient satisfaisants pour l'analyse de la Chlorophylle a et des pigments accessoires à partir d'échantillons d'eau de mer provenant d'une large gamme de concentrations.

 

Références

Claustre H., Hooker S., Van Heukelem L., Berthon J.F., Barlow R., Ras J., Sessions H., Targa C., Thomas C.S., Linde van der D., Marty J.C., 2004. An intercomparison of HPLC phytoplankton pigment methods using in situ samples: application to remote sensing and database activities. Marine Chemistry 85: 41-61.

Jeffrey S.W., Mantoura R.F.C. and Wright S.W., 1997. Phytoplankton pigments in oceanography : guidelines to modern methods. UNESCO publishing, Paris, 661 pp.