POMME 1-2-3
Programme Océan Multidisciplinaire Méso Echelle
Base de fichiers de données bateau
PIGMENTS HPLC
Hervé Claustre (DR CNRS , email : claustre@obs-vlfr.fr, Tel : 04 93 76 37 29)
LOV - Caserne Nicolas BP 08 Quai de la Darse 06238 Villefranche sur mer
Joséphine Ras (IE CNRS, email : jras@obs-vlfr.fr, Tel : 04 93 76 37 21)
Campagnes et legs:Pomme 1 leg 1 et leg 2
Pomme 2 leg 1 et leg 2
Pomme 3 leg1 et leg 2
Types d'observations et mesures effectuées :Mesures discrètes sur des profils verticaux de pigments phytoplanctoniques par méthode de chromatographie liquide à haute performance (HPLC).
Stratégie d'échantillonnage suivie
Sur chaque rosette durant les leg 1 et sur 3 rosettes par site sur les leg 2, 2,8 litres d'eau ont été prélevés entre 0 et 300 m puis filtrés (filtres GF/F). Ces filtres ont ensuite été conservés à l'azote liquide en attendant l'analyse, à terre, du contenu en pigments phytoplanctoniques par méthode HPLC.
Campagne |
Nombre profils |
Nombre d'échantillons |
Pomme 1 Leg 1 |
79 |
729 |
Pomme 1 Leg 2 |
18 |
166 |
Pomme 2 Leg 1 |
81 |
826 |
Pomme 2 Leg 2 |
12 |
846 |
Pomme 3 Leg 2 |
13 |
125 |
Total |
286 profils |
2812 échantillons |
Filtration : 2,8 L d'eau de mer sont filtrés à travers une membrane Whatman GF/F de 0,7 µm de porosité. Une mesure d'absorption particulaire est effectuée avant de stocker le filtre dans l'azote liquide.
Extraction dans 3 mL de méthanol. Après 30 minutes à -20°C, les filtres sont broyés à l'aide d'une tige à ultra-sons puis retournés au congélateur. 30 minutes plus tard l'extrait est clarifié à travers une membrane Whatman GF/C de 1,3 µm de porosité et conservé à -20°C jusqu'à analyse (sous 24h).
Analyse par Chromatographie Liquide à Haute Performance (Instrumentation : série 1100 d'Agilent Technologies et passeur automatique AS3000 de Thermo-Finnigan). La séparation est effectuée avec un gradient entre un mélange méthanol:acétate d'ammonium (70 :30) et une solution de 100% méthanol à travers une colonne à phase inverse Hypersil C8 (MOS ; 3µm ; 3mmx100mm). La détection est assurée par un détecteur à barette de diodes avec des signaux à 440 nm et à 667 nm. Les différents pics sont identifiés sur la base des temps de rétention mais surtout grâce à leur spectre d'absorption (logiciel Chemstation). Une description plus détaillée de la méthode est décrite par Claustre et al. (2003).
La quantification repose sur un calcul impliquant la surface des pics et leurs coefficients d'extinction spécifiques respectifs. Les concentrations sont en mg.m-3.
La calibration est effectuée à l'aide de 8 standards externes (Péridinine, 19'-Butanoyloxyfucoxanthine, Fucoxanthine, 19'-Hexanoyloxyfucoxanthine, Alloxanthine, Zéaxanthine, Chlorophylle b, Chlorophylle a) fournis par DHI (International Agency for C14 determination, Danemark). Les facteurs de réponse sont d'abord déterminés par spectrophotométrie suivie par l'analyse par HPLC. Ces facteurs de réponse sont ensuite utilisés dans le calcul des coefficients d'extinction spécifiques pour ces 8 standards. Les coefficients d'extinction spécifiques des autres pigments sont dérivés soit de calibrations précédentes ou de la littérature (Jeffrey et al. 1997).
La validation est assurée à plusieurs niveaux :
-
l'utilisation d'un standard interne (beta-apo-8'-carotenal) permet de corriger pour les pertes durant l'extraction et/ou l'injection.
-
L'analyse d'une solution contenant uniquement du standard interne tous les 10 échantillons, permet de contrôler la bonne précision de l'appareil au cours d'une séquence d'analyse.
-
Les valeurs de Chlorophylle a Totale ont été comparées aux valeurs de fluorescence des fichiers bouteilles, afin de déceler des problèmes ou erreurs de manipulation.
-
Les valeurs de Chlorophylle a Totale ont également été comparées aux mesures d'absorption particulaires (effectuées sur le même filtre)
Performance de la méthode : cette méthode fait preuve d'une grande sensibilité avec des limites de détection pour la Chlorophylle a d'environ 0,001 mg.m-3 ainsi qu'une bonne résolution entre la Divinyl Chlorophylle a et la Chlorophylle a. La précision de la méthode est généralement supérieure à 99%. La participation à un exercice d'intercomparaison HPLC impliquant 4 laboratoires différents (Claustre et al, 2003), a montré que les résultats du LOV étaient satisfaisants pour l'analyse de la Chlorophylle a et des pigments accessoires à partir d'échantillons d'eau de mer provenant d'une large gamme de concentrations.
Références
Claustre H., Hooker S., Van Heukelem L., Berthon J.F., Barlow R., Ras J., Sessions H., Targa C., Thomas C.S., Linde van der D., Marty J.C., 2004. An intercomparison of HPLC phytoplankton pigment methods using in situ samples: application to remote sensing and database activities. Marine Chemistry 85: 41-61.
Jeffrey S.W., Mantoura R.F.C. and Wright S.W., 1997. Phytoplankton pigments in oceanography : guidelines to modern methods. UNESCO publishing, Paris, 661 pp.
Echéances pour une première mise à disposition des données de la base de fichiers :
Les données de pigments pour les legs 2 de chaque campagne (Pomme 1, 2 et 3) pourront être disponibles pour la base de données en début février 2002. Ces données seront soumises sans validation finale jusqu'à ce que la base de données soit complétée par les legs 1 de chaque campagne.
Les données du leg 1 de Pomme 1 seront soumises le 1ier avril 2002. Les données du leg 1 de Pomme 2 seront soumises le 31 mai 2002. Les données du leg 1 de Pomme 3 seront soumises le 1ier août 2002.
Une fois la base de données au complet elle sera qualifiée comme " validée " en fin août 2002.
Structure des fichiers - Px leg1
Pomme 1 Leg 1. | Les paramètres sont : |
Ship: navire |
Cruise: campagne |
Latitude |
Longitude |
Date: (jj/mm/aa) |
Heure: (hh :mm :ss) |
STATION: numéro de l'échantillon Pxyyyzz (x : numero de campagne ; yyy : numero de CTD ; zz : numéro de bouteille) |
Site: numéro du site x-y: (x : numero de campagne ; y : numéro du site) |
CTD: numéro de CTD |
Bouteille: numéro de bouteille |
Prof (m): profondeur en mètres |
PIGMENTS: Les concentrations sont en mg. m-3. Les valeurs non-detectables sont représentées par 0.000001 |
Chlorophyll c3 |
Chlorophyll c1+c2 |
Peridinin |
19'-Butanoyloxyfucoxanthin |
Fucoxanthin |
19'-Hexanoyloxyfucoxanthin |
Prasinoxanthin |
Violaxanthin + Neoxanthin: (coéluent) |
Neoxanthin |
Diadinoxanthin |
Alloxanthin |
Diatoxanthin |
Zeaxanthin |
Lutein |
Lutein 5,8-epoxide |
Chlorophyll c-like non polaire 1 |
TChlb: (Chlorophyll b + DV Chlorophyll b) |
Divinyl Chlorophyll a |
Chl a: (allomer+ Chlorophyll a + epimer) |
Total Chl a: (Chlorophyll a + DV Chlorophyll a) |
Chlorophyll c-like non polaire 2 |
Carotenes : (somme des carotènes) |
Chlorophyll c-like1 @ 2.6 min |
Chlorophyllid a |
Flags: indiquent une particularité : |
A: le pic de Chlorophyll a allomer ressemble spectralement à un mélange de DV chlorophyll a et de Chlorophyll a |
B : le pic de Chlorophyll a épimer ressemble spectralement à un mélange de DV Chlorophyll a et de Chlorophyll a |
DP : Diagnostic pigments (Peri + 19'BF + 19'HF + Fuco + Allo + TChlb + Zea) |
pico Chla = Tchla x (Zea + TChlb)/DP |
nano Chla = Tchla x (19'BF + 19'HF + Allo)/DP |
micro Chla = Tchla x (Fuco + Peri)/DP |
Fp = (Fuco + Peri)/(Fuco + Peri + 19'BF + 19'HF + Allo + TChlb + Zea) |
Structure des fichiers - Px leg2
Les paramètres sont :
Navire
CAMPAGNE
Latitude
Longitude
Date (jj/mm/aa)
Heure (hh :mm :ss)
STATION : numéro de l'échantillon Pxyyyzz (x : numero de campagne ; yyy : numero de CTD ; zz : numéro de bouteille)
Site : numéro du site x-y (x : numero de campagne ; y : numéro du site)
CTD : numéro de CTD
Prof (m) : profondeur en mètres
Pigments : Les concentrations sont en mg. m-3.
Chlorophyll c3
Chlorophyll c1+c2
Peridinin
19'-Butanoyloxyfucoxanthin
Fucoxanthin
19'-Hexanoyloxyfucoxanthin
Prasinoxanthin
Violaxanthin
Neoxanthin
Diadinoxanthin
Alloxanthin
Diatoxanthin
Zeaxanthin
Lutein
Lutein 5,8-epoxide
Chlorophyll c-like non polaire 1
TChlb (Chlorophyll b + DV Chlorophyll b)
Divinyl Chlorophyll a
Chl a (allomer+ Chlorophyll a + epimer)
Total Chl a (Chlorophyll a + DV Chlorophyll a)
Chlorophyll c-like non polaire 2
Carotenes
Flags : indiquent une particularité :
A : le pic de Chlorophyll a allomer ressemble spectralement à un mélange de DV Chlorophyll a et de Chlorophyll a
B : le pic de Chlorophyll a épimer ressemble spectralement à un mélange de DV Chlorophyll a et de Chlorophyll a